细胞是生命存在和活动的基本单位。荧光显微镜作为细胞生物学的基本工具，其分辨率受到阿贝衍射极限的约束，这限制了对细胞中精细结构的研究。自2000年，多种超分辨率荧光显微成像技术陆续被发明出来，突破了传统的衍射极限。在这些技术中，结构光照明显微镜（SIM）因其较小的光漂白、光毒性以及较快的成像速度，而被广泛用于活细胞成像。

当对活细胞进行三维成像时，三维结构照明显微镜（3D-SIM）将所有维度的空间分辨率提高了一倍，更有助于人们了解细胞器三维结构和动态过程。然而，由于需要在轴向上逐层移动样本，每层需采集15帧SIM原始图像，成像一个三维体积（如1.5微米厚度）通常需要花费数秒钟，导致时间分辨率受到极大的限制，也容易引入运动伪影。发展一种能够对活细胞内的细胞器进行快速、三维超分辨成像的新方法，对推动生物医学领域的基础研究具有极其重要的意义。

本次研究提出的快速三维多平面 SIM （3D-MP-SIM）方法，通过构建出新的正向物理模型，并在此基础上，开发对应的新型光路设计与重建算法，不损失3D-SIM的空间分辨率（横向约120纳米；轴向约300纳米）的同时，3D-MP-SIM将时间分辨率提高了约8倍，更显著减少了动态结构成像中的运动伪影。在对内质网进行高速长时程的成像中，新方法最快可以达到11赫兹的三维体成像速度。这一方法也可拓展应用于双色实验，观察细胞内和细胞间的细胞器在三维空间中快速紧密的互作过程。这些结果都证明了 3D-MP-SIM 在观测亚细胞水平上的动态行为和相互作用的潜力。

3D-MP-SIM利用三光束干涉照明与多平面探测方法，同时获取整个体积内的样本信息。采集到的原始图像频谱（图1c）。然而在传统的3D-SIM的正向模型中，它的轴向超分辨率频谱信息在原始频谱中已经体现在了轴向扩展的OTF中（图1d）。若仅采用3D-SIM利用横向相移分离横向混叠频谱的方法，则无法求解3D-MP-SIM数据中混叠的轴向高频信息。为此，需要在横向相位变化之外引入额外的轴向相移。具体在实验系统中，可以通过搭建光学延迟线（图1e）或0级光相位调制等方式来实现结构光轴向相位的改变。3D-MP-SIM的重构流程与传统SIM相似，包含以下几个关键步骤（图1f）：频谱分离、参数估计、频谱移位和维纳滤波等，其中最重要的步骤在于对轴向拓展的±1阶频谱的处理。为了获得更为稳定的成像结果，3D-MP-SIM采用了两步重建流程：首先利用横向相移分离0阶、±1阶和±2阶的频谱组分，然后使用轴向相移进一步分离±1阶的上下两部分。这种方法增强了3D-MP-SIM在真实生物样本重建时的稳定性和准确性。

     

图1：3D-MP-SIM原理图，系统光路图和重构流程图。a-d，多平面SIM原理图，多焦点SIM原理图，3D-MP-SIM原理图，3D -SIM原理图。e，3D-MP-SIM 系统光路图。f，3D-MP-SIM重构流程图。

通过上述方法，3D-MP-SIM可以实现与3D-SIM分辨率相当的成像结果。在固定细胞的微管实验中，3D-MP-SIM成像效果与3D-SIM相当（图2a-d）。这证实了3D-MP-SIM三维超分辨能力。 更重要的是，3D-MP-SIM时间分辨率的提高有助于减少运动伪影并提高活细胞的动态成像效果。例如，研究团队拍摄了次级内体（图2e-g），在3D-SIM中，快速运动的次级内体在轴向截面上呈现为拉长的线状结构，显示出明显的运动伪影。而在3D-MP-SIM中，次级内体基本保持了圆状的轮廓结构，运动伪影得到显著抑制。相应的仿真模拟结果也证实了3D-MP-SIM能够有效减少快速移动对象的运动伪影。此外，最快可以使用1毫秒的曝光时间实现11赫兹的三维体成像速度，进而成功观察到管状内质网和片状内质网的快速动态过程（图2h-j）。

图2：3D-MP-SIM分辨率表征和活细胞快速三维超分辨成像。a-d，固定细胞中微管成像。e-g，次级内体动态成像。h-j，内质网动态成像。

3D-MP-SIM还可拓展到双色实验，观察细胞器结构在三维空间中快速紧密的相互作用过程。得益于其快速的体成像能力，可以更真实地记录细胞器之间的相互作用。利用双色3D-MP-SIM技术，重建图像展现出线粒体外膜和内膜的清晰动态过程。在轴向交叉剖面上可以观测到线粒体内膜的快速动态变化，并在另一区域捕捉到线粒体纳米管与其他线粒体进行交流互动的快速动态过程（图3a-c）。此外，研究团队在活细胞中同时标记了线粒体和内质网，观察到诸如管状内质网延伸穿过线粒体外膜凹陷的中心孔，以及内质网缠绕线粒体等丰富而快速的动态互作过程（图3d-g）。

     

图3：3D-MP-SIM用于双色成像。a-c，线粒体内膜和外膜动态成像。d-g，线粒体和内质网动态成像。

此外，为进一步提升轴向成像厚度，研究团队进一步结合样本的轴向扫描和多层同步成像，在轴向扫描步进满足一定条件的情况下，3D-MP-SIM采集到的多个原始数据可以拼接为连续整体，运用同样的理论方法重构。这意味着该方法理论上可以拍摄任意厚度的样本，通过两次扫描，拼接得到了4.26微米厚的样本，实现了全细胞厚度的三维超分辨率成像（图4a-f）。

图4：3D-MP-SIM用于全细胞厚度成像。a-c，全细胞微管成像。d-f，全细胞线粒体成像。

综上所述，3D-MP-SIM代表了活细胞三维超分辨显微成像领域的重要进展。3D-MP-SIM首次将3D-SIM的时间分辨率大幅提升并保持其空间分辨率不变，为活细胞超分辨率成像领域带来了重要突破。其在阐明纳米尺度的亚细胞动态行为方面展现出巨大潜力，为生命科学研究提供了强有力的工具。

北京大学黄小帅研究员、施可彬教授、陈良怡教授和重庆邮电大学范骏超副教授、肖斌教授为该论文共同通讯作者，北京大学博士生陈骞、苟文和北京大学肿瘤医院科研助理路雯清为该论文共同第一作者。黄小帅课题组博士生魏宇弘、李昊宇，硕士生王程玉和科研助理李杰为本工作做出了重要贡献。此外，该工作还得到了北京大学第三医院李正迁课题组、重庆邮电大学毕秀丽课题组、西湖大学章永登课题组、北京大学未来技术学院陈知行课题组和刘贝课题组的重要支持和帮助。本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金项目、新基石科学基金和北京大学肿瘤医院学科交叉项目等基金项目的支持。