背景介绍    

   

外泌体作为一种装载蛋白质、脂质和核酸等的纳米级细胞外囊泡，目前已经发现在治疗应用中具有巨大的潜力。鉴于其广泛的应用，适当的深低温保存和储存方法对于基于外泌体的治疗方法的临床成功应用很重要。因为低温降低了酶活性并保持了外泌体的完整性，外泌体通常保存在-80°C或-170°C的磷酸盐缓冲液（PBS）中。然而，越来越多的证据表明，这种储存方法可能会对外泌体浓度、物理特性和功能产生负面影响。目前的深低温保存技术，如慢速冷冻或玻璃化，通常依赖于高浓度的深低温保护剂(CPA),如DMSO或二糖，以防止膜破裂和渗透性损伤。然而，高浓度(超过40% w/v)的CPA可能具有对哺乳动物细胞的毒性。海藻糖的使用具有低溶解度和膜通透性的限制，可能引起渗透性应激。使用海藻糖辅助外泌体保存，会导致处理后的外泌体尺寸偏大。冻干是另一种深低温保存方法，其回收率约为85%。同样，冻干法保存的外泌体也会有一些负面影响，导致处理后的外泌体出现更大的尺寸分布。总的来说，外泌体保存和储存方法需要得到进一步开发和改进，而了解膜抗低温损伤的分子机制对于推进其深低温保存技术至关重要。

   

北京大学临床高等研究院陈扬研究员团队、北京协和医学院黄超兰教授团队、中国科学院理化技术研究所王健君研究员团队在Nano Letters杂志上发表题为“Tetraspanin 4 Mediates Cholesterol-Dependent Exosome Membrane Protection from Cryodamage”的论文，主要介绍了TSPAN4及其家族蛋白在外泌体冷冻保存中的重要作用。 第一作者为北京大学第一医院已毕业博士生纪锐、北京大学基础医学院博士生王泓力，通讯作者为北京大学临床高等研究院陈扬副研究员、北京协和医学院黄超兰教授、中国科学院理化技术研究所刘樟副研究员。

 

研究团队首先评估了来自多种细胞来源的外泌体在深低温保存后的恢复情况。发现来自RAW264.7、MDA-MB-231和HeLa细胞的外泌体数量在深低温保存后减少，而破裂的外泌体数量显著增加。来自L929、3T3-L1和MDA-MB-435细胞的外泌体在浓度和形态方面没有明显变化。

接着，研究团队利用基于质谱的蛋白组学方法分析了不同细胞来源的外泌体在经过深低温处理后会产生不同结果的可能原因，发现多种TSPAN家族蛋白在能抵抗冷冻处理的外泌体中富集。且在产生对冷冻敏感的外泌体的细胞中过表达TSPAN家族蛋白，结果显示多种TSPAN蛋白均能提升外泌体对冷冻处理的抵抗能力。

进一步，研究团队在产生冷冻抗性的外泌体的L929细胞中敲除了多个Tspan基因，其中TSPAN4敲除使得外泌体在冷冻处理后出现明显损失。而在L929-TSPAN4KO细胞中回补TSPAN4，能够恢复外泌体对冷冻处理的抵抗能力，说明TSPAN4在保护外泌体免受冷冻损伤方面发挥了重要作用。

最后，研究团队探索了TSPAN4作为外泌体工程化手段的潜力。实验结果显示，TSPAN4过表达细胞产生的外泌体具有对冷冻处理的抵抗能力。同时，其尺寸分布与野生型细胞产生的外泌体没有明显差异。此外，蛋白组学数据显示，与L929-TSPAN4KO细胞产生的外泌体相比，L929-WT与L929-TSPAN4细胞产生的外泌体之间差异蛋白数量有限。

总的来说，该研究团队发现来自L929-WT细胞的外泌体中的TSPAN4对于维持膜完整性和提供抵抗冻融应力的保护是必不可少的。并提出了一种可以与其他深低温保存技术相兼容的外泌体保存策略。

参考文献：

Ji, R., Wang, H., Zheng, X., Shi, D., Tian, W., Gao, P., Li, Y., Wen, Y., Wang, J., Liu, Z., Wong, C. C. L., & Chen, Y. (2025). Tetraspanin 4 Mediates Cholesterol-Dependent Exosome Membrane Protection from Cryodamage. Nano letters, 10.1021/acs.nanolett.5c00572 .Advance online publication.